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识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标——CISPR系列之Cas13a


导读:CRISPR是一种出色的基因组编辑工具,比较熟悉的是来自化脓链球菌的Cas9(SpCas9),不过这并不是唯一的选择。一种新型核酸酶Cas13a(以前称为C2c2)正开始进入人们的视野,它具有独特的性质,进一步扩展了CRISPR工具箱.我们将介绍一下Cas13a的独特性质以及各种应用。

Cas蛋白的分类

根据Cas蛋白的分类和效应复合物的性质主要分为两大类Class 1和Class 2,六种不同类型。
1类系统包括类型I、III、IV,效应复合物由多个Cas蛋白 (具有一个或多个内切酶活性组分) 组成并与crRNA紧密结合,
2类系统包括类型II、V和VI,只有一个具有内切酶活性的多结构蛋白。
II类CRISPR-Cas系统CRISPR/Cas9系统已用于基因敲除和敲入以及基因组标记等,方便基因操作和基因组研究。
而VI类系统又叫CRISPR-Cas13系统,是向导RNA介导的RNA靶向的内切酶系统,从15年被发现至今一共鉴定出四个亚型:
VI-A(Cas13a/C2c2),VI-B(Cas13b),VI-C(Cas13c)和VI-D(Cas13d)
已经开始运用于RNA的敲低,RNA定点编辑,RNA检测以及RNA剪接调控

Cas13a的独特之处

Cas13a最初是由Broad研究所的研究人员发现的。2015年,Shmakov及其同事利用Cas1作为“诱饵”,来鉴定细菌基因组中与CRISPR相关联的蛋白。通过此次分析,他们鉴定出53个候选基因,总共分成三大类:C2c1、C2c2和C2c3。C2c1和C2c3与Cpf1有些类似,不过它们需要tracrRNA和crRNA才能切割DNA目标,而Cpf1仅需要crRNA。

再来看C2c2(也就是Cas13a)与Cas9的区别。最大的区别在于Cas13a结合并切割RNA,而Cas9切割DNA。从结构上来看,Cas13a含有两个HEPN结构域,而Cas9用HNH和RuvC结构域来切割DNA目标。HEPN结构域对Cas13a切割RNA目标是必需的。另外,与Cas9类似,Cas13a分子中关键残基的突变可以形成核酸酶活性缺失的Cas13a(dCas13a),它能够结合RNA目标但无法切割。

表1:比较常用的CRISPR酶

     

名称

结构域

向导RNA

目标

PAM

切割机制

Cas9

HNH、RuvC

tracrRNA/crRNA

DNA

5' NGG

DNA目标中平末端的特定双链断裂

Cpf1

类似RuvC

crRNA

DNA

5' TTN

DNA目标中带有5’垂悬的特定双链断裂

Cas13a

2x HEPN

crRNA

RNA

3' A、U 或C

特定RNA的切割

     

Cas13a的作用机制

大家都知道,Cas9利用tracrRNA和crRNA来实现与DNA目标的结合和切割。不过,Cas13a只需要24个碱基的crRNA,它通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用,并通过Cas13a的一系列构象变化来促进目标的切割。与Cas9一样,Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配,不过若存在2个错配,那切割效率就大大降低。它的PFS序列(相当于PAM序列)位于间隔区的3’端,由A、U 或C碱基组成。

Cas13a还有一个特别之处,那就是Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标,它就转入了一种酶促“激活”状态,这时它将结合并切割其他的RNA,而不管它们是否与crRNA同源,或是否存在PFS。这一点与Cas9截然不同。对于细菌而言,这种性质是有意义的。若细菌被噬菌体感染,它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态,以限制感染在整个群体中的传播。

Cas13a的潜在应用

那么,Cas13a可以应用在哪些方面呢?对于初学者来说,Cas13a可用来结合和切割RNA目标,不过这方面的应用可能受限,因为一旦目标被破坏,Cas13a就会失去控制。因此,Cas13a的突变体研究有望成为新的热点,使其特异切割RNA目标,但是随后不会切割非特异的RNA。此外,人们可利用dCas13a来分离群体中的特定RNA序列,或利用荧光标记的dCas13a来研究活细胞中的RNA加工。

     

最近,张锋实验室还发表了一篇文章,证明了Cas13a可以高特异性地检测RNA单分子。他们开发出的SHERLOCK系统可检测血清、尿液和唾液中低浓度的寨卡病毒,并确定病毒载量,区分不同病毒株。它还可以对人类DNA进行基因分型,并鉴定游离DNA中的肿瘤突变。未来,Cas13a有望继续扩大CRISPR的应用范围。田克恭团队建立了新方法:Crispr-Cas13a可视化检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)

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