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Cat. Number
His标签蛋白纯化介质(IDA)
Chemical Name
His标签蛋白纯化介质(IDA)
Qty 1
1ml
Qty 2
5ml
References

1. 产品简介

His标签蛋白纯化介质适用于His标签融合蛋白的纯化,采用该产品可快速从细胞发酵液中提取His标签融合蛋白。

His标签蛋白纯化介质(IDA)以IDA为金属螯合配基,常规螯合Ni2+(常称为镍填料),亦可根据客户需要螯合Cu2+Co2+Zn2+等离子基团。

请注意,选择该产品时切勿在缓冲液中添加巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂,将导致金属离子脱落(如需要添加还原剂组分,建议选择NTA产品)。

2. 产品特性

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3. 应用

采用His标签蛋白纯化介质对组氨酸(His)标记蛋白质进行分离纯化的过程通常包括平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。

平衡:用5~10CV的平衡缓冲液平衡层析柱,至流出液电导和pH不变(与平衡液一致)。实际操作中,一般选用中性/弱碱性(pH 7~8)的高盐(0.15~1.0 M NaCl或其它中性盐)缓冲液。其中常用磷酸盐缓冲体系,如20 mM PB+0.5 M NaCl, pH 7.4。对于结合力较强的带组氨酸标记的蛋白质,平衡缓冲液中可加入低浓度(20~40 mM)的咪唑。

进料:样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制;低浓度样品溶液可用平衡液透析;高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱,样品应经离心或微滤处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

为了减少杂蛋白在层析柱上的吸附,可在确保目标蛋白吸附的情况下适当增加样品缓冲液中的咪唑。对于包涵体蛋白,相应地可在平衡、上样和洗脱的缓冲液中加入8M 尿素或6M 盐酸胍。

淋洗:上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱:洗脱一般有两种方式,一是采用竞争试剂,如咪唑(0~0.5M)、组氨酸(0~0.05M)、氯化铵(0~2M)等将蛋白质从柱子上置换下来;二是减小pH值,洗脱目标蛋白,大多数蛋白质在pH 4~6的范围内可被洗下来。用竞争试剂咪唑或减小pH值的方法洗脱蛋白质,金属离子仍结合在柱子上;若用竞争试剂组氨酸或氯化铵洗脱蛋白质,会将金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来。

洗脱缓冲液中必须加入0.15~1.0 M NaCl以消除离子交换作用。梯度洗脱最好在起始平衡液的恒定pH下进行,可采用线性梯度或阶越式梯度洗脱。

4. 再生

介质使用5-10次(具体与样品特性、样品体积、金属离子等有关)后,或者鳌合其它金属离子前,需要进行再生处理。

1)脱Ni

5-10倍体积的EDTA溶液(0.2M EDTA+0.5M NaCl, pH 7.0)清洗介质,然后用5-10倍体积的去离子水清洗以去除残留的EDTA

2)清洗

采用5-10倍体积的0.5-1M NaOH2M NaCl溶液或50%乙醇或者30%异丙醇)清洗介质,除去色素或者其他强吸附蛋白,然后用10-20倍体积的平衡缓冲液或去离子水清洗以去除残留溶液。

3)挂Ni

采用2-5倍体积的0.2M NiSO4溶液与介质混合搅拌4h,然后过滤。(亦可柱上清洗)

4)平衡

采用20-30倍体积的去离子水清洗介质,去除残留的Ni2+。如发现清洗液仍呈现蓝色,应继续清洗,直至蓝色消失。

采用2-5倍体积的20%乙醇清洗介质,结束后储存于4-8℃环境中。


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