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Cat. Number
HK21632-96S
Chemical Name
HK21632-96S 转氢酶-1活性测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/96S
References

线粒体转氢酶-1 (Mitochondrial hydrogenase-1, TH-1) 位于线粒体的内膜上,又称为线粒体复 合体六,催化 NADH+ NADP+ 和 NAD++NADPH 相互转化。催化正向反应称为 TH-1。线粒体 NADH 含量增加时会导致线粒 体膜的 H+电化学梯度升高,因而促进了电子传递链上 ROS 的产生。TH-1 促进 NADH 转换 为 NADPH,从而提高线粒体的抗氧化能力。


检测原理:

NADH 和 NADPH 均在 340 nm 有特征吸收,因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340 nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP+)替代 NADP+,TH-1催 化 APADP+ 还原生成的 APADPH 在 375 nm 有特征光吸收,因此通过测定 375 nm 光吸收增加速率,来计算 TH-1 活性。


需自备的试剂和器材:

 1.可见分光光度计/酶标仪

 2.37℃恒温箱

 3.系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器

 4.去离子水或蒸馏水


产品组成:

编号

规格

储存条件

试剂R1

液体×1 瓶

-20℃

试剂R2

液体×1 瓶

-20℃

试剂R3

液体×1 瓶

2-8℃

试剂R4

粉剂×2 支

-20℃

试剂R5

粉剂×2 支

-20℃


实验步骤:

一、样品处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离

1. 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂R1,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 将匀浆液 600g,4℃离心 5min。

3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2(此步可选做)。

5. 步骤 4 中的沉淀即为线粒体,加入 500uL 试剂R2,超声波破碎(冰浴,功率 20% 或 200W, 超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 TH-2 活性测定。

二、试剂准备

工作液的配制:临用前将试剂R4, R5 转移到 试剂R3中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴 5min,现配现用;

三、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 375 nm,蒸馏水调零。

2. 在 微量石英比色皿或 96 孔板中按顺序加入下列试剂:

试剂名称

测定管 (μL)

样品

20

工作液

180

混匀,立即记录375 nm 处初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。

四、TH-1 含量计算

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本鲜重计算

单位的定义:每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T

(2)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性 (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T

※ 蛋白定量检测建议使用本公司:BCA 蛋白检测试剂盒 

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性 (nmol/min /104 cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

V 反总:反应体系总体积;

ε:APADH 摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;

d:比 色皿光径,1cm;

V 样:加入样本体积;

V 样总:加入提取液体积;

T:反应时 间,10min;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量,g;

500:细菌或细胞总数,500 万。

2. 用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按样本鲜重计算

单位的定义:每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-1活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T

(2)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性 (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T

※ 蛋白定量检测建议使用本公司:BCA 蛋白检测试剂盒 

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性 (nmol/min/104 cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

V 反总:反应体系总体积;

ε:APADH 摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;

d:96 孔板光径,0.5cm;

V 样:加入样本体积;

V 样总:加入提取液体积;

T: 反应时间,10 min;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量,g;

500:细菌或细胞总数,500 万。


本试剂盒仅供科研使用!

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