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Cat. Number
HK21625-24S
Chemical Name
HK21625-24S 中性蛋白酶测试盒(可见分光光度法)
Qty 1
50T/24S
References

中性蛋白酶(NP)在一定的温度和中性pH条件下,催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点,中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。


测定原理:

中性条件下,NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。


需要的仪器,耗材:

1、可见分光光度计

2、台式离心机

3、可调式移液器

4、玻璃比色皿

5、研钵/匀浆器

6、水浴锅

7、磁力搅拌器

8、1.5 mL EP 管

9、冰和蒸馏水


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶
试剂R1粉剂×1 瓶2-8℃
试剂R2粉剂×1 瓶
试剂R3液体×1 瓶
试剂R4液体×1 瓶
标准品液体×1 支


实验步骤:


注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(具体比例可以参考文献)

称约0.1g 组织,加入1mL 提取液,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心10min,取上清,即粗酶液,置冰上待测。或直接称取0.1g 酶制品,加入1mL 提取液,置冰上待测。

二、试剂准备

1、试剂R1:临用前加入10mL 蒸馏水,充分溶解。

2、试剂R2:临用前加入10mL 提取液,沸水浴中搅拌溶解。

3、标准品:20μmol/mL 标准酪氨酸。

三、测定步骤

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至680nm,蒸馏水调零。

2、试剂R1、试剂R2和试剂R3置于30℃水浴保温30min以上。

3、标准溶液的配制:临用前将20μmol/mL标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/mL标准溶液使用,现用现配。

4、样本测定 

1.5mLEP管中分别加入下列试剂:

试剂名称(μL) 对照管测定管空白管标准管
粗酶液
100100

试剂R1200
试剂R2
200
                                             混匀后30℃水浴保温10min
试剂R1
200
试剂R2200
                                   混匀后10000rpm 4℃离心10min,取上清
上清200200

蒸馏水

200
标准品


200
试剂R31000100010001000
试剂R4200200200200

混匀后30℃水浴保温20min。取1000μL于1mL玻璃比色皿,于680nm测定光吸收,分别记为A对照管、A测定管、A空白管、A标准管。并计算ΔA测定=A测定管-A对照管、ΔA标准=A标准管-A空白管。

四、NP活性计算

1、按样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol 酪氨酸为一个酶活单位。

NP 活性(U/mg prot)=C 标准品×ΔA 测定÷ΔA 标准×V1÷(Cpr×V2)÷T 

2、按样本质量计算

酶活单位定义:30℃每克样本每分钟催化水解产生1μmol 酪氨酸为一个酶活单位。

NP 活性(U/g 质量)=C 标准品×ΔA 测定÷ΔA 标准×V1÷(W×V2÷V3)÷T 

C 标准品:标准酪氨酸溶液浓度;

Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量,g;

V1:酶促反应总体积;

V2:加入反应体系中粗酶液体积;

V3:粗酶液总体积,1mL;

T:催化反应时间,10min。


注意事项:

若反应较弱,(A 测定管-A 对照管)差值较小,可适当延长反应时间(20-30min),即第一步水浴时间,最后计算酶活时对公式进行修改。


本试剂盒仅供科研使用!

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