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| Cat. Number | HK21271-96S |
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| Chemical Name | HK21271-96S 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/48S |
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| References | 谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇。但以过氧化氢为底物进行检测会受同样可以分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的影响，因为过氧化氢酶的酶活性会干扰谷胱甘肽过氧化物酶的测定。 测定原理： GPX 催化H2O2 氧化GSH，产生GSSG，GSH 能与DTNB 生成在412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm下吸光度的下降即可反应GPX 的活性。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1:5~10 的比例（建议称取0.05 g 组织，加入1 mL 提取液）进行冰浴匀浆。5000 rpm，4℃离心10 min，取上清置冰上待测 (如上清不清澈可以离心更长时间)。 2、细菌、细胞：按照细胞数量104 个：提取液体积（mL）500~1000:1 的比例（建议500 万细胞加入1 mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3 min）然后5000 rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测 (如上清不清澈可以离心更长时间)。 3、血清（浆）等液体：直接测定。 二、试剂准备 1、试剂R1：临用前加入3.3 mL 稀释液，充分溶解； 2、试剂R2：临用前按2 μL 试剂R2：10 mL 蒸馏水的比例稀释试剂R2，现用现配； 3、试剂R3：瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可； 4、标准品：10 mg 还原型谷胱甘肽。临用前加入0.405 mL 稀释液溶解为80 μmol/mL 的标准溶液备用。 三、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至412 nm，蒸馏水调零。 2、将80 μmol/mL 标准液用稀释液稀释为0.08 μmol/mL 的标准溶液，现用现配。 3、操作表：(在1.5 mL 离心管中依次加入下列试剂)
充分混匀，4000 rpm 常温离心5 min，取上清于EP 管或者96 孔板中。
充分混匀，室温静置15 min，测定412 nm 下的吸光度，分别记为A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算ΔA 测定=A 对照管-A 测定管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。 四、GPX 活性计算 1、抑制百分率的计算 抑制百分率=(A 对照管-A 测定管) ÷（A 对照管-A 空白管）× 100% 尽量使样本的抑制百分率在30-70%范围内，越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样本；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。 2、GPX 活性计算 （1）按蛋白浓度计算 活力单位定义：每mg 蛋白在反应体系中每分钟催化1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位。 GPX (U/mg prot) =ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标）×1000×V 酶促÷（Cpr×V 样）÷T （2）按样本质量计算 活力单位定义：每g 样本在反应体系中每分钟催化1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位。 GPX (U/g 质量)= ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标）×1000×V 酶促÷(V 样÷V 样总×W)÷T （3）按细胞数量计算 活力单位定义：每104 个细胞在反应体系中每分钟催化1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位。 GPX (U/104 cell)=ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标）×1000×V 酶促÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T （4）按液体体积计算 活力单位定义：每mL 液体在反应体系中每分钟催化1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位。 GPX (U/mL)= ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标）×1000×V 酶促÷V 样÷T C 标：标准液混合物的浓度； V 酶促：酶促反应体系体积； V 样：酶促反应中加入样本体积； V 样总：提取液体积； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL； T：反应时间，5 min； 细胞数量：以万计； W：样本质量，g； 1000：换算系数，1 μmol=1000 nmol。 注意事项： 1、吸光度若大于1.5 时，建议将样本用提取液稀释后进行测定。 2、建议一次不要做过多样本以免检测时间过长影响显色，使测定不准确。 本试剂盒仅供科研使用! |
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