服务热线
021-60498804
| Cat. Number | HK21256-48S |
||||||||||||||||||||||||||
| Chemical Name | HK21256-48S 谷氨酸合成酶(GOGAT)测试盒( 紫外分光光度法) |
||||||||||||||||||||||||||
| Qty 1 |
50T/48S |
||||||||||||||||||||||||||
| References | 谷氨酸合成酶(GOGAT)广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。 测定原理： GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时NADH氧化生成NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、试剂准备 1、工作液的配制：取试剂R2、试剂R3、试剂R4各一支加入30 mL 试剂R1中溶解，现用现配，可分装后-20℃保存，避免反复冻融。 三、测定步骤 1、紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、工作液提前配置，平衡至室温。 3、样本测定：
四、GOGAT 活性计算 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 GOGAT（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T （2）按样本质量计算： 单位的定义：每g 组织每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GOGAT（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T （3）按细菌或细胞数量计算： 单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GOGAT（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T V 反总：反应体系总体积； ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； V 样总：加入提取液体积； T：反应时间，5min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500 万； 109：单位换算系数，1mol =109nmol。 注意事项： 1、测定期间样本在冰上放置，以免变性和失活。 2、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。 3、当A1 大于1.5 或者ΔA 大于0.6（酶标仪ΔA 大于0.4）时，建议将样本用蒸馏水稀释后测定，当ΔA 过小时，可以延长酶促反应时间（10min 或15min）或者加大加入的样本体积进行测量。 4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。 本试剂盒仅供科研使用! |
||||||||||||||||||||||||||
Copyright © 2022 上海惠诚生物科技有限公司
沪ICP备2021037845号-6
