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| Cat. Number | HK21231-96S |
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| Chemical Name | HK21231-96S 单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。 测定原理： MDHAR 催化 NADH 还原MDHA 生成 AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。 需自备的仪器和用品： 研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪和双蒸水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 2、细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500-1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL提取液），冰浴超声破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 二、试剂准备 1、试剂R2：临用前加入2 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存； 2、试剂R3：临用前加入3.33 mL 蒸馏水充分溶解待用，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融； 3、试剂R4：液体置于试剂瓶内EP 管中。临用前加2 mL 试剂R1充分溶解，可溶解后分装-20℃保存，避免反 复冻融。 三、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2、试剂R1在25℃水浴锅中预热30min。 3、依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂
迅速混匀后于340nm 比色，记录30s 和150s 的吸光值，分别记为A1、A2，ΔA=A1-A2，得到ΔA 测定管、ΔA空白管。 四、MDHAR 活性计算 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下： 1. 按蛋白浓度计算 MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。 MDHAR (U/mg prot) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T 2. 按样本质量计算 MDHAR活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。 MDHAR (U/g 质量) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T 3. 按细胞数量计算 MDHAR活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。 MDHAR (U/104 cell) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol； V反总：反应体系总体积； V样：加入反应体系中上清液体积； V样总：提取液体积； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定； W：样本质量，g； T：反应时间，2min； 细胞数量：以104为单位计量，万个。 b.使用96孔UV板测定的计算公式如下： 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。 本试剂盒仅供科研使用! |
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