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Cat. Number
HK21221-96S
Chemical Name
HK21221-96S 超氧阴离子检测试剂盒(酶标板法)
Qty 1
100T/96S
References

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用,但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用,导致机体细胞和组织代谢异常,从而引起多种疾病。


测定原理:

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO2-,NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下,生成红色的偶氮化合物,在530nm处有特征吸收峰,根据A530值可以计算样品中O2-含量。


需自备的仪器和用品:

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、研钵/匀浆器、微量玻璃比色皿/96 孔板、氯仿和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶2-8℃
试剂R1液体×1 瓶2-8℃
试剂R2液体×1 瓶2-8℃
试剂R3液体×1 瓶2-8℃
试剂R4液体×1 瓶2-8℃
标准品
液体×1 瓶2-8℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 植物、动物组织:称取约0.1g 样本,加入提取液1mL,充分研磨,12000rpm,4℃,离心20min,取20μL 上清测定蛋白含量,其余上清作为待测样本。

2. 血清或培养液:直接测定。

二、测定步骤:

1. 分光光度计或酶标仪预热30min 以上,调节波长至530nm,蒸馏水调零。

2. 标准溶液的制备

取适量亚硝酸钠标准液,将其稀释为0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125μmol/mL 的标准溶液,用这些标准管做标准曲线。

3. 操作表

试剂名称(uL)空白管测定管标准管
标准溶液--40
样本-40-
提取液1006060
试剂R1808080
                                                                                     混匀,37℃水浴20min
试剂R2606060
试剂R3606060
                                                                                     混匀,37℃水浴20min
试剂R4100100100
混匀,8000rpm,25℃,离心5min,小心吸取上层水相200μL,蒸馏水调零,微量玻璃比色皿/96 孔板,测定530nm处吸光值,计算ΔA 标准=A 标准管-A 空白管,ΔA 样本=A 测定管-A 空白管。(空白管只需做1-2 次)

四、超氧阴离子含量计算公式:

1. 标准曲线的绘制:以ΔA 标准为y 轴,标准溶液浓度为x 轴,绘制标准曲线y=kx+b。

2. 超氧阴离子含量的计算:将ΔA 样本带入方程得到x 值(μmol/mL)。

(1)按照样本质量计算

超氧阴离子含量(μmol/g 质量)=2x×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W)

超氧阴离子产生速率(μmol/min/g 质量)=2x×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W)÷T

(2)按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量(μmol/mg prot)=2x×V 样本÷(V 样本×Cpr)

超氧阴离子产生速率(μmol/min/mg prot)=2x×V 样本÷(V 样本×Cpr)÷T

(3) 按照血清或培养液体积计算

超氧阴离子含量(μmol/mL)=2x

超氧阴离子产生速率(μmol/min/mL)=2x÷T

V 样本:参与反应样本体积;

V 提取:提取过程中加入的提取液体积;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量,g;

T:反应时间,20min。


注意事项:

1、如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

2、样本制备好后,立刻进行测定,请勿将样本进行长时间的低温保存,以免影响测定结果。

3、试剂四有一定的毒性,请操作时做好防护措施。


本试剂盒仅供科研使用!

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